在不附加任何保護(hù)劑下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在﹣130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞凍存時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，待復(fù)蘇時重新進(jìn)入生長分裂周期。

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30 分鐘。采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。

將離心機(jī)調(diào)節(jié)至 800 轉(zhuǎn)，5 分鐘。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細(xì)胞培養(yǎng)基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中預(yù)熱。

首先消毒雙手和超凈臺。取約 10ml細(xì)胞培養(yǎng)基放于 15 毫升離心管中。

配置細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞，按無血清培養(yǎng)基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細(xì)胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分后，輕輕吸打混勻，置于室溫下待用。

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，進(jìn)行瓶口消毒，棄去細(xì)胞原來的培養(yǎng)基。按每 25cm2/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)基以立即終止消化。

采用無菌槍頭輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的15毫升離心管內(nèi)。

配平離心：采用天平配平兩端，每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5 分鐘。

采用羅氏 CASY-DT 快速細(xì)胞計數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。加入 10ml CASY-ton至以標(biāo)記 viable 的管子中，加入 100µl 細(xì)胞懸液，顛倒混勻三次，可進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。可見每毫升懸液中有活細(xì)胞總數(shù)。

取出凍存管，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。

離心后，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為每毫升有 5×10?為宜。

將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般一個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細(xì)胞凍存懸液為宜。

嚴(yán)密封口后，進(jìn)行程序性降溫凍存：

首先 ﹣4 ℃ 30 分鐘，20 ℃ 30 分鐘，﹣80 ℃過夜，最后進(jìn)行液氮保存。